O gênero Streptococcus compreende espécies clinicamente importantes que são responsáveis por uma grande variedade de pelo sucesso destes microrganismos na persistência de algumas infecções. O objetivo deste estudo foi investigar e comparar a formação de biofilmes por 19 espécies do gênero associadas a infecções humanas e animais. Biofilmes foram formados nos meios BHI, THB e HIB e em diferentes concentrações de glicose ou de sacarose, e avaliados pelo método semiquantitativo do cristal violeta. A influência de ampicilina e de eritromicina sobre a atividade e biomassa dos biofilmes foi avaliada por de ensaios de viabilidade utilizando azul de Alamar e pelo método semiquantitativo do cristal violeta, respectivamente. A presença de DNA e proteínas na substância polimérica extracelular foi determinada em ensaios de destacamento, após tratamento com DNase ou proteinase K. A arquitetura dos biofilmes e a distribuição de células vivas e mortas foram observadas por microscopia ótica de luz e confocal de varredura a laser (MCVL). Todas as amostras foram produtoras de biofilmes. As espécies S. pyogenes e S. agalactiae foram fortes produtoras, de acordo com os padrões definidos (DO570nm > 1,0). Os valores de DO dos biofilmes formados em diferentes meios de cultura variaram de acordo com a espécie. A adição de açúcares, resultou no aumento da biomassa dos biofilmes. Porém, este aumento não foi proporcional a concentração. As concentrações mais favoráveis de glicose variaram entre as espécies. Entretanto, a maioria apresentou maior biomassa em 0,25% de glicose. Para a sacarose, os resultados não variaram muito nas diferentes concentrações testadas. A concentração inibitória do biofilme (CIB) para ampicilina e eritromicina atingiu valores superiores a 40.000 vezes se comparada a CIM de células em cultura. As espécies que apresentaram CIBs menores foram: S. suis, 80 µg/mL para ampicilina e eritromicina; S. porci 640 µg/mL apenas para ampicilina e S. pyogenes, 640 µg/mL apenas eritromicina. Entretanto, a maioria das espécies apresentou valores de biomassa semelhantes ao biofilme controle, na ausência de antimicrobianos. Os dados obtidos revelaram que tanto ampicilina quanto eritromicina quando em concentrações equivalentes a ½ da CIM induziram significativamente a formação de biofilme. O tratamento com proteinase K causou uma redução dos biofilmes da maioria das amostras. Porém, S. agalactiae, S. dysgalactiae subsp equisimilis, S. iniae, S. mutans, S. parauberis, S. porcinus e S. pyogenes foram as que apresentaram valores significativos (p<0,05) sugerindo a formação de estruturas ricas em proteínas. O tratamento com DNaseI resultou no destacamento dos biofilmes produzidos por S. agalatiae, S. dysgalactiae subsp equisimilis, S. equi subsp equi, S. pyogenes e S. urinalis. Entretanto, considerando-se os dois controles utilizados nos testes apenas os resultados obtidos para as amostras de S. agalactiae e S. pyogenes apresentaram resultados significativos (p<0,05). S. agalactiae e S. pyogenes apresentaram imagens representativas de maior biomassa, onde foram observadas regiões compostas por filamentos longos, que a coloração utilizada demonstrou serem constituídos de DNA extracelular. A MCVL revelou variações na relação entre a quantidade de células vivas e mortas, sugerindo tempos de maturação espécie-específicos. Apesar de estudos adicionais serem necessários, os dados obtidos demonstraram características particulares de cada espécie mesmo filogeneticamente relacionadas.
Streptococcus includes clinically important species that are responsible for a wide variety of infections in human and animals. The biofilms formation has been identified as responsible for the success on the persistence of these microorganisms in some infections. The aim of this study was to analyze the biofilm formation by 19 streptococcal species associated with human and animal infections. Biofilms formation was determined in BHI, THB and HIB and in the presence of glucose or sucrose (0,25% - 1,0%). The biofilms were evaluated by a semiquantitative method of crystal violet. The susceptibility to ampicillin and erythromycin were assessed by viability assays using Alamar blue and the semiquantitative method of crystal violet. The presence of DNA and proteins in the extracellular polymeric substance was determined by detachment assays, after treatment with DNaseI or proteinase K. The biofilms structural architecture and the distribution of live and dead cells were examined by optical microscopy and confocal laser scanning microscopy. All strains were biofilms producers. The species S. agalactiae and S. pyogenes were characterized as strong producers, according to the previous defined standards (DO570nm> 1.0). The biofilm formed in BHI and HIB by S. canis was significantly higher (p <0.05) than in THB. The addition of sugars, for most species, resulted in significant increase in biomass of biofilms (p <0.05). However, this increase was not proportional to the increase of concentration. The more favorable glucose concentrations varied between species, however, most had higher biomass in biofilms formed in HIB medium plus 0.25% glucose. In contrast to sucrose, the results of most of the samples were similar in different concentrations. For most samples, the biofilm inhibitory concentration (BIC) was found as > 640 mg / mL. The species showing lower BICs were: S. suis, 80 mg / mL of ampicillin or erythromycin, S. porci 640 g / mL of ampicillin and S. pyogenes, 640 mg / mL of erythromycin. Most species showed DO values similar to the control biofilm in the absence of antimicrobials. Our data revealed that both ampicillin and erythromycin in subMICs induced the formation of streptococcal biofilm significantly (p <0.05). Treatment with proteinase K caused the biomass reduction in most of most the strains. However, S. agalatiae, S. dysgalactiae subsp equisimilis, S. iniae, S. mutans, S. parauberis, S. pyogenes and S. porcinus showed the significative values, suggesting the presence of protein-rich structures. S. agalatiae, S. dysgalactiae subsp equisimilis, S. equi subsp equi, S. urinalis and S. pyogenes showed biofilm detachment due to DNaseI treatment, but only the species S. agalactiae and S. pyogenes showed significant values. S. agalactiae and S. pyogenes showed greater biomass in confocal and optical images, presenting long filaments of extracellular DNA. The CLSM also revealed variations in the relationship between the amount of dead and living cells, suggesting maturation times species-specific. Although additional studies are needed, the data showed particular characteristics on biofilm formation.
