Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) causam doença em humanos e animais. Além de doença diarreica, determinam complicações sistêmicas como síndrome hemolítica urêmica (SHU), púrpura trombótica trombocitopênica ou ainda sequelas como hipertensão arterial e isquemia miocárdica, entre outras. A ampla distribuição de STEC no trato gastrointestinal de uma variedade de animais, particularmente bovinos e outros ruminantes, indica o caráter zoonótico da doença. STEC, além de colonizarem bovinos, podem contaminar alimentos como a carne e o leite e sobreviver no solo, esterco, pastagens e na água, importantes veículos para a sua transmissão. A maioria das cepas STEC invadem enterócitos e podem persistir intracelularmente. Há evidências de que a localização intracelular de STEC constituiria uma estratégia eficiente para a colonização do animal hospedeiro. Alguns patógenos têm a capacidade de explorar as vias endocíticas da célula hospedeira para a sua internalização. Embora muito se saiba quanto aos conteúdos e as estruturas endocíticas, pouco se sabe sobre os mecanismos de endocitose específicos pelos quais estes conteúdos são recrutados e internalizados. No presente estudo foram investigados aspectos da invasão de células Caco-2 por cepas STEC representativas de alguns sorotipos envolvidos em doença humana, como EDL931 (O157:H7), 282/2 (O8:H19) e 784/1 (O113:H21). Foram empregados testes de inibição da invasão bacteriana por drogas que interferem em vias endocíticas (cloridrato de clorpromazina, metil-β-ciclodextrina e filipina ) e imunofluorescência para a detecção de proteínas marcadoras de endossomas precoces (Rab5, EEA-1) endossomas tardios (Rab7) e lisossomos (LAMP1), além da sonda LysoTracker Red DND-99. A clorpromazina foi eficiente na inibição da atividade invasora de todas as cepas STEC, caracterizando o envolvimento da via da clatrina na internalização de STEC, pelo mecanismo de zippering. Para algumas cepas (sorotipos O157:H7 e O113:H21) um segundo mecanismo, via lipid rafts/caveolina pareceu também participar. Todas as cepas mostraram colocalização com os marcadores EEA-1, Rab7 e LAMP1, mas não com Rab5. A colocalização com Rab 7, marcador de endossomas tardios só ocorreu 3 horas pós-infecção, sendo possível que este tempo contribua para retardar a fusão dos fagossomas aos lisossomos, favorecendo a sobrevivência e multiplicação inicial do microrganismo. Entre 1 e 3 horas pós-infecção, apenas parte dos fagossomos contendo STEC demonstrou marcação por LAMP1 e fusão com lisossomos, avaliada pelo uso da sonda LysoTracker Red DND-99. Nesta etapa da infecção foram encontradas numerosas bactérias íntegras em fagossomas não marcados com LAMP-1 ou com a sonda. Já em fase tardia da infecção (48 horas), ocorreu uma redução no número de bactérias intracelulares e apenas uma minoria destas não associada a lisossomos, conservando a sua integridade estrutural. Estes resultados sugerem que uma subpopulação das STEC intracelulares sobrevive e persiste, evitando de alguma forma a sua destruição pelos lisossomas. Tal característica pode ser relevante para a prolongada persistência de STEC no hospedeiro animal.
Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) causes disease in humans and animals. In addition to diarrheal disease, they determine systemic complications such as hemolytic uremic syndrome (HUS), thrombotic thrombocytopenic purpura or sequelae such as arterial hypertension and myocardial ischemia. The widespread distribution of STEC in the gastrointestinal tract of a wide variety of animals, particularly cattle and other ruminants, indicates the zoonotic nature of the disease. STEC, besides efficiently colonizing cattle, can contaminate food such as meat and milk and survive on soil, manure, pastures and water. Most STEC strains invade enterocytes and may persist intracellularly. There is evidence that the intracellular location of STEC would be an efficient strategy for persistent colonization of the host animal. Some pathogens have the ability to exploit host cell endocytic pathways for their internalization. Although much is known about endocytic contents and structures, little is known about the specific endocytosis mechanisms by which these contents are recruited and internalized. In the present study were investigated aspects of Caco-2 cells invasion by STEC strains representative of some serotypes involved in human disease, such as EDL931 (O157: H7), 282/2 (O8: H19) and 784/1 (O113: H21). Inhibition tests for bacterial invasion by drugs that interfere in endocytic pathways (Chlorpromazine Hydrochloride, Methyl-β-Cyclodextrin and Filipine) and immunofluorescence for the detection of early endosomal marker proteins (Rab5, EEA-1), late endosomes (Rab7) and lysosomes (LAMP1), in addition to the LysoTracker Red DND-99 probe were used. Chlorpromazine was very efficient in inhibiting the invading activity of all STEC strains, characterizing the involvement of the clathrin pathway in the STEC internalization by the zippering mechanism. For some strains (serotypes O157:H7 and O113:H21) a second invasive mechanism, via lipid rafts / caveolin also appears to participate. All strains showed colocalization with the endosomal markers EEA-1, Rab7 and LAMP1, but not with Rab5. The colocalization with Rab7, a late endosome marker, only occurred 3 hours post-infection, it being possible that such a delay contributes to slow up the fusion of phagosomes to lysosomes, favoring the survival and initial multiplication of the microorganism. Between 1 and 3 hours post-infection, only few of the STEC-containing phagosomes showed LAMP1 labeling and lysosomal fusion, assessed by the use of the LysoTracker Red DND-99 probe. At this stage of infection were found numerous bacteria intact in non-LAMP-1-labeled phagosomes or acidic lysosomes. In the late phase of infection (48 hours), a notable reduction in the number of intracellular bacteria, and only a minority of these are not associated with lysosomes, maintaining their structural integrity. Suggesting that a subpopulation of intracellular STEC can survive and persist, somehow preventing its destruction by lysosomes. Such a feature may be relevant for the prolonged persistence of STEC in the animal host.
