Cleome spinosa is used in folk medicine and as garden plant. This species has been investigated by biotechnological strategies, which has resulted in the establishment of different in vitro systems by tissue culture techniques. However, long-term maintenance of in vitro cultures in active growth conditions show risks, as contamination and somaclonal variations. Cryopreservation, the storage of biological material at ultra-low temperature, is an efficient long-term conservation system, allowing the maintenance of plant germplasm for indefinite periods of time. This study aimed to establish cryopreservation protocols for in vitro plants of C. spinosa using vitrification and v-cryo-plate techniques. Explants from different regions were evaluated for their ability to regenerate from small-sized fragments. For preculture, the material was maintained for 24 hours in a medium containing 0.3 M sucrose or increasing concentrations of suc. (0.25 M - 0.50 M), remaining at each concentration for 24 hours. Then, the material was exposed to loading solution and to the vitrification solutions PVS2 (25°C and 0°C) and PVS3 (25°C) for different exposure times (15, 30, 45, 60, 90, 120 min). To rewarming, the material cryopreserved by the Vitrification technique was immersed in a water bath, while in the V-Cryo-plate technique the process was direct by immersing the cryo-plates in a high osmolarity solution (unloading). Unfrozen and cryopreserved explants were transferred to unloading solution and were inoculated in regrowth medium (MS + 0.5 mg.L-1 BAP). During regrowth the material was kept in darkness for 24 hours and followed by gradual transfer to light. After 30 days, the material was transferred to MS0 to evaluate the recovery rates. Shoot tips showed the best regeneration capacity from small fragments and were selected for cryopreservation studies. The preculture protocols showed no recovery differences in the presence of the vitrification solutions at 25°C. However, in the presence of PVS2 at 0°C, higher recovery values were reached by cryopreserved shoot tips pre-treated with a progressive increase in sucrose concentration. PVS2-based protocols with lower exposure times were more effective for cryopreservation at 25°C when compared to protocols at 0°C. To PVS3based protocols intermediates exposure times were more efficient in the vitrification technique, while higher recovery rates were achieved in the V-Cryo-plate technique after longer exposure times. The V-Crio-plate was the most effective technique for shoot tips cryopreservation in C. spinosa, mainly when it was used in association with the PVS2 at 0°C. Shoot tips pre-treated with a progressive increase in sucrose concentration and exposed to PVS2 (0°C) for 90 minutes, using the V-Cryo-plate technique, reached 70% recovery rates. The regenerated plants showed normal phenotypic aspect and maintained their regenerative capacity over time in culture
Cleome spinosa é uma espécie utilizada na medicina tradicional e também com fins ornamentais. A espécie vem sendo investigada sob o ponto de vista biotecnológico, já tendo sido estabelecidos diferentes sistemas in vitro por técnicas de cultura de tecidos. Entretanto, a manutenção in vitro em condições de crescimento ativo apresenta riscos, como a ocorrência de contaminações e variações somaclonais. A criopreservação, que trata da manutenção do material biológico em baixas temperaturas pela imersão em nitrogênio líquido, representa um eficiente sistema de conservação em longo prazo, permitindo a manutenção do germoplasma vegetal por períodos de tempo indeterminados. O presente trabalho teve como objetivo definir protocolos de criopreservação pelas técnicas de vitrificação e v-crioplacas para plantas cultivadas in vitro da espécie C. spinosa. Explantes de diferentes regiões (ápices caulinares, segmentos nodais e internodais) foram avaliados quanto à sua capacidade de regeneração a partir de fragmentos de tamanho reduzido. Para a criopreservação, foi avaliado o pré-cultivo do material por 24 horas em meio contendo 0,3 M de sacarose ou em concentrações crescentes de sacarose (0,25 M - 0,50 M), por 48 horas. A seguir, o material foi exposto à solução de loading e às soluções de vitrificação PVS2 (25°C e 0°C) e PVS3 (25°C) por diferentes tempos (15; 30; 45; 60; 90; 120 min). Para a etapa de reaquecimento na técnica de vitrificação, o material foi imerso em banho-maria, enquanto que na técnica de V-Crioplacas o processo ocorreu diretamente através da imersão das crioplacas na solução de alta osmolaridade (unloading). Explantes não resfriados e os criopreservados foram transferidos para solução unloading e inoculados em meio de recuperação (MS + 0,5 mg.L-1 de BAP), sendo mantidos no escuro por 24 horas, seguido de transferência gradual para luz. Após 30 dias, o material foi transferido para meio MS0 para o acompanhamento da recuperação. A regeneração de ápices caulinares ocorreu a partir de fragmentos de pequeno tamanho (1,5 mm) os quais foram selecionados para os estudos de criopreservação. Não foram observadas diferenças nas taxas de recuperação dos ápices em relação aos dois protocolos de pré-cultivo testados, quando as soluções de vitrificação foram usadas a 25°C. Porém, a aplicação de PVS2 a 0°C aumentou a taxa de recuperação para ápices pré-tratados com progressivo aumento da concentração de sacarose. Quanto ao tempo de exposição às soluções crioprotetoras, protocolos com PVS2 a 25°C foram mais eficazes em menores tempos de exposição, quando comparados àqueles estabelecidos com o uso da solução a 0°C. Para o PVS3, a determinação do melhor tempo de exposição teve relação direta com a técnica empregada, sendo tempos intermediários mais adequados na vitrificação e altos tempos mais eficientes para Vcrioplacas. A técnica de V-crioplacas foi a mais eficaz para a criopreservação, sobretudo com a solução PVS2 a 0°C. Ápices criopreservados por esta técnica, submetidos ao pré-cultivo com aumento progressivo da concentração de sacarose e expostos ao PVS2 (0°C - 90 min), alcançaram taxas de recuperação de 70%. As plantas recuperadas apresentaram aspecto fenotípico normal e mantiveram sua capacidade de regeneração ao longo do tempo em cultivo
